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今天推送的文章发表在Angew.Chem.Int.Ed.的“Biocatalytic Enantioselective β-Hydroxylation of Unactivated C?H Bonds in Aliphatic Carboxylic Acids”，通讯作者为扬州大学生物科学与技术学院的王喜庆教授和安徽大学生命科学学院的何超教授。

C-H羟基化面临着多种合成挑战，包括反应性、选择性和官能团耐受性。以催化方式对未活化的脂肪族 C-H键进行无定向基团、化学选择性、区域选择性和对映选择性羟基化仍然是一项艰巨任务。对于具有多个相同亚甲基和附加官能团的高度灵活的线性脂肪族羧酸来说尤其如此（图 1b）。与合成方法不同，酶进化为明确定义的底物结合口袋，该口袋选择性地将部分底物定位到反应剂所在的催化中心，导致C-H氧官能化的高度化学、区域和立体控制。

细胞色素 P450酶在所有生命领域的初级和次级代谢过程中参与多种底物的氧化。然而，由于它们的高度选择性结合口袋导致狭窄的底物范围；未活化的脂肪族C-H键的对映选择性羟基化仍然不高；活性、稳定性以及对辅因子、氧化还原伙伴和电子供体的要求等问题进一步使这些酶在有机合成中的应用复杂化。在本研究中，作者报告了在P450BSβ向非天然底物定向进化方面的研究，产生了一种突变体，该突变体现在能够在各种具有各种官能团的底物中对未活化的脂肪族C-H键进行高度区域和对映选择性羟基化。

先前对P450BSβ的研究表明，短链脂肪酸在酶的底物结合通道中结合较松散，导致反应性低。但短链脂肪酸可以作为一般酸碱催化剂（短链FA的羧酸基 – Arg242的胍基）与H₂O₂生成活性中间体“化合物 I”。这些“诱饵分子”使酶能够氧化非天然底物，例如苯乙烯和乙苯。生型P450BSβ的窄底物范围归因于缺乏稳定酶活性中心底物所需的足够相互作用。为了使 P450BSβ酶能够接受非天然化合物，作者以短链FA（辛酸）为初始底物进行了定向进化研究，以期增强底物和工程酶之间的相互作用。

首先对P450BSβ晶体结构中距底物7 ?以内的残基进行了位点饱和诱变。野生型的转化率仅为15%，区域选择性较差（Cβ/Cα 33%:67%）（图 2）。针对残基 V74、L78、Q85、V170 和 G290 的五个文库显示出比野生型更高的底物转化率和β-羟基化选择性（图 2）。受益于α-羟基化和脱羧副反应的减少，双突变体P450BSβ-L78I/G290I 表现出良好的底物转化率（60%）和β-区域选择性（Cβ/Cα 80%:14%）（图 2）。三重突变体P450BSβ-L78I/Q85H/G290I显示出提高的底物转化率（60%→90%）和β-羟基化选择性（Cβ /Cα 80 %:14 %→86 %:2 %）。纯化的P450BSβ-L78I/Q85H/G290I突变体表现出良好的催化活性，对辛酸的转换频率 (TOF)为632 min^-1，转换数 (TON)为4724。此外，这种三重突变酶耐受高浓度的H₂O₂。

基于P450BSβ-L78I/Q85H/G290I，作者系统地研究了底物范围（表 1, 2-3），首先评估了羧酸链长对酶促结果的影响（表 1）。0.1 mol % 的三重突变体在制备规模（0.5 mmol）下顺利羟基化各种饱和FAs 1a-k，以41-86%产率提供所需的β-OH FAs 2a-k) 且具有出色的对映选择性（>99% ee），这可能是由于改进的底物-酶结合相互作用。

手性β-羟基羧酸常见于生物活性分子中，可作为β-氨基酸、β-内酯/内酰胺、双环庚烯酮和聚羟基链烷酸酯的合成前体，在天然产物合成、药物发现和生物材料中具有广泛的应用。为了证明该突变体的可扩展性和实用性，使用底物1c(5 mmol)作为底物进行反应，酶催化剂浓度为0.04 mol%，最后得到705mg手性产物2c（表 1），其新安装的β-OH基序可用作手柄，以便在需要时轻松实现多样化。

接下来研究了这种酶促转化的官能团耐受性（表 2），测试了多种非天然底物。结果发现该酶对末端和内部烯烃/炔烃基序均具有良好的耐受性，以55-75%的产率和 >99% ee提供β-OH产物2l-p。溴、胺、腈和酯等官能团对反应性或选择性（2q-t）几乎没有影响。此外，在反应过程中，羟基等氧化敏感部分也没有受到影响，顺利地产生了手性二醇2u。此外，该工程化酶能够接受具有较短碳链的环戊基基序的羧1v，以71%的产率和 >99% ee提供相应的β-OH产物2v。

考虑到生物活性天然产物和药物中芳香核心的普遍存在，作者进一步探索了与芳香基序相连的脂肪族羧酸（表 3）。供电子甲氧基可以在苯环的邻位、间位和对位进行修饰，而不会显着影响反应的反应性和选择性（2w-y）。该酶也可以催化含吸电子和电子中性取代基（如-CO2Me和-H）、含卤化物基序（如-F和-Cl）、含有杂芳烃如呋喃基和吡咯基基序的的脂肪族羧酸的β羟基化（2z-ae）。总体而言，P450BSβ-L78I/Q85H/G290I 突变体很好地接受了具有不同链长、官能团和（杂）芳烃的多种脂肪族羧酸，这表明在合成和药物化学中具有巨大的潜在应用。

为了阐明这种酶促反应优异的反应性和选择性，作者以2.0 ?的分辨率（PDB ID：7WYG）获得了与棕榈酸与P450BSβ-L78I/Q85H/G290I 突变体复合物的晶体结构。与野生型P450BSβ 相比（图 3a），突变体晶体结构（图 3b）表明，G290I取代是底物构象变化的主要原因。由于Arg242锚定底物的羧酸基团，庞大的疏水异亮氨酸残基作用于底物的C?部分，将Cβ-C?推向催化中心，并改变底物烷基尾的方向。同时，L78I和Q85H取代协同作用使锚定残基R242的构象发生细微变化，从而使底物更深入底物结合通道移动（图 3c）。总的来说，这些突变将β-亚甲基推向铁中心，而将α-亚甲基推离铁中心（图 3c）。此外，与野生型蛋白质相比，L78I、Q85H和G290I引入更大的氨基酸使改进的突变体中血红素远端口袋的体积减少了约 25 %（381 ?3对503 ?3）（图 3d，e），可能会增强与具有较短烷基尾底物的结合。

为了更好地解释实验观察到的选择性，作者以恶臭假单胞菌的P450cam（PDB ID：1DZ9）为模板构建了野生型和进化蛋白的氧合复合结构。进化的蛋白质结构中两个α-H原子与化合物I氧之间的距离分别为3.4和4.3 ?，比野生型P450BSβ结构中的距离（2.8和3.7 ?）长（表 4）。相比之下，两个Cβ-H原子更接近化合物I氧（工程蛋白为1.6和2.4 ?，野生型P450BSβ为5.5和5.5 ?），因此说明了这种酶促转化的出色β-区域选择性。在两个Cβ-H原子中，pro-(R)-H比pro-(S)-H更靠近化合物I氧（1.6对2.4 ?），这导致实验观察到的 (R)-构型。

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